frizzled Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401592-ACT

FZD2 codifica o recetor humano Frizzled-2, um recetor de Wnt com sete hélices transmembranares que se liga a ligandos Wnt e coordena a sinalização a jusante tanto pela via dependente de β-catenina (canónica) como pelas vias de polaridade planar/cálcio (Ca2+) (não canónicas). Ao regular programas transcricionais, a dinâmica do citoesqueleto e a polaridade celular, o FZD2 contribui para a padronização do desenvolvimento, o comportamento de células estaminais/progenitoras e a homeostase dos tecidos. Alterações na sinalização Wnt–Frizzled envolvendo o FZD2 têm sido associadas a proliferação aberrante, invasão e transição epitélio–mesênquima em múltiplos contextos de doença, tornando-o um alvo frequente para estudos mecanísticos de reprogramação (rewiring) da via.

frizzled-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FZD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

frizzled-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FZD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FZD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de frizzled-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FZD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de frizzled-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via frizzled-2 em células tumorais com expressão de FZD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.