Flt-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400684-ACT

FLT4 kodiert die menschliche Rezeptor-Tyrosinkinase Flt-4 (VEGFR-3), einen zentralen Signalübertragungsknoten in lymphatischen Endothelzellen, der VEGF‑C und VEGF‑D bindet und dadurch Lymphangiogenese, vaskuläres Remodeling und das Überleben von Endothelzellen reguliert. Nach Ligandenbindung aktiviert Flt-4 nachgeschaltete Signalwege wie PI3K–AKT, MAPK/ERK und PLCγ–PKC, um Proliferation, Migration und Permeabilitätsantworten zu koordinieren. Eine fehlregulierte FLT4-Signalgebung wird mit einer abnormen Entwicklung des Lymphgefäßsystems und Störungen der Gewebeflüssigkeitshomöostase in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext tumorassoziierter Lymphangiogenese und metastatischer Ausbreitung untersucht. Als Membranrezeptor mit kontextabhängigen Signalausgängen ist FLT4 ein gut zugängliches Ziel, um Ligand–Rezeptor-Dynamik, Rezeptor-Trafficking und Signalweg-Cross-Talk in der Gefäßbiologie zu analysieren.

Flt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FLT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Flt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FLT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FLT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Flt-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FLT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Flt-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Flt-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FLT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.