FANCC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416477-ACT

Das humane FANCC kodiert eine zentrale Komponente des Fanconi-Anämie-(FA)-DNA-Reparaturwegs, der die Antwort auf DNA-Interstrand-Crosslinks und replikationsassoziierte Läsionen koordiniert. FANCC ist an der Bildung und Funktion des FA-Core-Komplexes beteiligt und unterstützt die Monoubiquitinierung von FANCD2/FANCI sowie die nachgeschaltete Aktivierung der homologen Rekombination und von Mechanismen zur Stabilisierung der Replikationsgabel. Durch diese Aktivitäten trägt FANCC zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität, zur Koordination von Zellzyklus-Checkpoints und zum Schutz vor endogenem und exogenem genotoxischem Stress bei. Eine Störung oder Dysfunktion von FANCC ist mit der Biologie der Fanconi-Anämie und weiter gefassten Phänotypen genomischer Instabilität verknüpft, die für Studien zu Mechanismen des Knochenmarkversagens und zu krebsassoziierten Verwundbarkeiten der DNA-Reparatur relevant sind.

FANCC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.