Plásmido CRISPR de Activación (h) FAM20A: sc-409969-ACT

FAM20A codifica una proteína secretada y asociada al aparato de Golgi que funciona como un miembro catalíticamente inactivo de la familia FAM20 y actúa como socio regulador de FAM20C, influyendo en la fosforilación de proteínas extracelulares y secretadas. Mediante esta modulación de la señalización en la vía secretora, FAM20A contribuye a la organización de la matriz extracelular, la formación del esmalte y procesos asociados a la mineralización en tejidos epiteliales y odontogénicos. La alteración de la actividad de FAM20A se ha vinculado con defectos en la amelogénesis y con fenotipos de calcificación ectópica, lo que subraya su relevancia para los mecanismos de biomineralización y de homeostasis tisular. Estas características convierten a FAM20A en un objetivo útil para estudiar la regulación del fosfoproteoma secretado, la remodelación de la matriz y los programas de diferenciación en modelos celulares humanos.

FAM20A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FAM20A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FAM20A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FAM20A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FAM20A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FAM20A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FAM20A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FAM20A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FAM20A en células tumorales con expresión de FAM20A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.