Plasmide CRISPR d'Activation (h) EVA1B: sc-412477-ACT

EVA1B (également connu sous le nom de FAM176B) code une protéine transmembranaire localisée principalement aux membranes intracellulaires, où elle a été associée à la régulation du trafic vésiculaire, à des processus liés à l’autophagie et à la signalisation de survie cellulaire. Des études récentes suggèrent qu’EVA1B influence des voies de réponse au stress qui façonnent l’homéostasie cellulaire, avec des effets dépendant du contexte sur la prolifération et les programmes inflammatoires. Une expression altérée d’EVA1B a été rapportée dans de multiples contextes pertinents pour les maladies, notamment des modifications transcriptionnelles associées au cancer et des phénotypes liés à l’immunité, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique pour l’interrogation des voies de signalisation. Dans des modèles cellulaires humains, la modulation d’EVA1B constitue un moyen de disséquer la manière dont la signalisation associée aux membranes s’articule avec la dynamique des organites et l’adaptation transcriptionnelle.

EVA1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EVA1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EVA1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EVA1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EVA1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EVA1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EVA1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EVA1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EVA1B dans les cellules tumorales présentant une expression de EVA1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.