Plasmide CRISPR d'Activation (h) ERp57: sc-401497-ACT

PDIA3 code pour ERp57, une isomérase de disulfures du réticulum endoplasmique (RE) qui coopère avec la calnexine et la calréticuline pour catalyser la formation et l’isomérisation des ponts disulfure lors du repliement des glycoprotéines. ERp57 contribue à la protéostasie du RE, au contrôle qualité et à des processus associés au RE liés à la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et au repliement oxydatif des protéines. Au-delà de la lumière du RE, PDIA3 a été impliquée dans la présentation de l’antigène via le chargement des peptides sur le CMH de classe I, ainsi que dans une régulation plus large des voies de signalisation du stress cellulaire. Une activité ou une expression dérégulée d’ERp57 est associée à une altération de l’homéostasie protéique et a été étudiée dans le contexte de l’inflammation, de la neurodégénérescence et de voies liées au cancer.

ERp57 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PDIA3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ERp57 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PDIA3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PDIA3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ERp57. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PDIA3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ERp57 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ERp57 dans les cellules tumorales présentant une expression de PDIA3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.