Plasmide CRISPR d'Activation (h) ERCC1: sc-400630-ACT

ERCC1 code une endonucléase spécifique de la structure qui forme un hétérodimère fonctionnel avec XPF (ERCC4) afin d’effectuer les étapes d’incision lors de la réparation par excision de nucléotides (NER) et de résoudre les pontages interbrins de l’ADN en coordination avec la voie de l’anémie de Fanconi. Par ces activités, ERCC1 contribue au maintien de la stabilité du génome, favorise la reprise des fourches de réplication et limite l’accumulation de lésions de l’ADN causées par les rayonnements ultraviolets et les agents génotoxiques. Une fonction ou une expression altérée d’ERCC1 est associée à une capacité de réparation de l’ADN diminuée, à une charge mutationnelle accrue et à une hypersensibilité cellulaire aux stress induisant des dommages à l’ADN. Les processus de réparation dépendants d’ERCC1 sont donc largement étudiés dans des contextes tels que la carcinogenèse, le maintien du génome lié au vieillissement et les mécanismes de résistance ou de susceptibilité aux dommages de l’ADN dans les systèmes expérimentaux.

ERCC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERCC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ERCC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERCC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERCC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ERCC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERCC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ERCC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ERCC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ERCC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.