ENT4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405115-ACT

SLC29A4 umano codifica il trasportatore equilibrativo di nucleosidi 4 (ENT4), un trasportatore di membrana plasmatica che facilita il flusso bidirezionale di adenosina e nucleosidi correlati, con un’attività di trasporto influenzata dal pH extracellulare. Modulando la disponibilità di nucleosidi, ENT4 può incidere sul metabolismo della via di recupero delle purine e sulle reti di segnalazione dell’adenosina extracellulare che modellano le risposte cellulari allo stress e i segnali infiammatori. L’attività di ENT4 è stata studiata in contesti in cui l’omeostasi dell’adenosina è alterata, inclusi processi cardiometabolici e neurobiologici. Un’espressione alterata di SLC29A4 è rilevante anche per studi su fenotipi monoaminergici e legati ai nucleosidi, a supporto del suo impiego come bersaglio nella mappatura di pathway e nella genomica funzionale.

ENT4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC29A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ENT4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC29A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC29A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ENT4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC29A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ENT4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ENT4 nelle cellule tumorali con espressione di SLC29A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.