Plasmide CRISPR d'Activation (h) ENDOG: sc-403263-ACT

L’ENDOG (endonuclease G) humaine est une nucléase localisée dans les mitochondries, impliquée dans l’entretien de l’ADN mitochondrial et dans l’exécution de programmes de mort cellulaire indépendants des caspases. Lors de la perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ENDOG peut se transloquer vers le noyau et contribuer à une dégradation de grande ampleur de la chromatine, reliant ainsi la signalisation du stress mitochondrial aux conséquences sur l’intégrité du génome. Elle intervient également dans les réponses au stress oxydatif et dans l’homéostasie bioénergétique, des processus souvent perturbés dans la neurodégénérescence, les modèles de lésion ischémique et les dysfonctions mitochondriales associées au cancer. Une activité ENDOG dérégulée a été étudiée dans des contextes de sensibilité modifiée à l’apoptose, d’instabilité du génome mitochondrial et de signalisation inflammatoire induite par de l’ADN endommagé.

ENDOG Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ENDOG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ENDOG Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ENDOG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ENDOG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ENDOG. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ENDOG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ENDOG au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ENDOG dans les cellules tumorales présentant une expression de ENDOG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.