Plasmide CRISPR d'Activation (h) Enamelin: sc-403738-ACT

ENAM code l’émailine, une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire, fortement exprimée par les améloblastes au cours du développement dentaire et incorporée à la matrice de l’émail en formation. L’émailine participe à la biomineralisation de l’émail en régulant la nucléation et la croissance des cristaux d’hydroxyapatite et en agissant de concert avec d’autres protéines de la matrice amélaire ainsi qu’avec des protéases de l’émail lors de la maturation de la matrice. Ces processus recoupent des voies d’organisation de la matrice extracellulaire et du métabolisme minéral qui contrôlent l’épaisseur, la dureté et l’architecture prismatique de l’émail. Les altérations génétiques d’ENAM sont fortement associées à des défauts héréditaires de formation de l’émail, notamment certaines formes d’amélogenèse imparfaite, faisant d’ENAM un modèle utile pour étudier les relations génotype–phénotype en biologie des tissus minéralisés.

Enamelin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ENAM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Enamelin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ENAM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ENAM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Enamelin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ENAM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Enamelin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Enamelin dans les cellules tumorales présentant une expression de ENAM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.