Plásmido CRISPR de Activación (h) Emt: sc-402628-ACT

El gen ITK humano codifica la quinasa de linfocitos T inducible por IL-2, una tirosina quinasa no receptora de la familia Tec que acopla la activación del receptor de células T (TCR) con la señalización posterior necesaria para la activación y diferenciación de los linfocitos. ITK participa en vías proximales del TCR que convergen en la activación de PLCγ1, el flujo de calcio, la señalización MAPK y programas transcripcionales que controlan la producción de citocinas y la función efectora. La actividad desregulada de ITK se asocia con un equilibrio Th1/Th2 alterado, inmunidad antiviral deteriorada y linfoproliferación anormal, lo que la hace relevante para estudios de la homeostasis inmunitaria y de los mecanismos de enfermedades inflamatorias. En el contexto de la proteína Emt, ITK constituye un nodo manejable para analizar la dinámica de la transducción de señales en células T humanas y linajes hematopoyéticos relacionados.

Emt El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ITK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Emt El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ITK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ITK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Emt. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ITK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Emt en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Emt en células tumorales con expresión de ITK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.