Plasmide CRISPR d'Activation (h) Eme1: sc-403404-ACT

EME1 humain code Eme1, une endonucléase spécifique de structure qui forme le complexe MUS81–EME1 afin de résoudre les jonctions de Holliday et d’autres intermédiaires d’ADN ramifiés générés au cours de la réplication de l’ADN et de la recombinaison homologue. Cette activité nucléase favorise la reprise des fourches de réplication, le traitement des fourches bloquées ou effondrées et le maintien de la stabilité du génome, reliant EME1 à la coordination du point de contrôle de la phase S et aux voies de réponse aux dommages de l’ADN. Une dérégulation de la réparation de l’ADN dépendante de MUS81–EME1 peut accroître l’instabilité chromosomique, une caractéristique de nombreux cancers, et est pertinente pour l’étude des mécanismes qui modulent la sensibilité au stress réplicatif et aux agressions génotoxiques.

Eme1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EME1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Eme1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EME1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EME1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Eme1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EME1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Eme1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Eme1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EME1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.