Plasmide CRISPR d'Activation (h) Elongin B: sc-402154-ACT

ELOB code l’Elongin B humain, un composant central du complexe Elongin BC qui stabilise les protéines adaptatrices de type SOCS-box et VHL et favorise l’assemblage des ligases E3 ubiquitine de type Cullin-RING. Via ces complexes, l’Elongin B contribue à la protéostasie dépendante de l’ubiquitine et à la régulation de programmes transcriptionnels liés à l’élongation de l’ARN polymérase II ainsi qu’aux voies de détection de l’oxygène. Les assemblages de ligases associés à ELOB influencent le renouvellement de régulateurs clés de la signalisation et du cycle cellulaire, reliant la fonction d’Elongin B aux réponses au stress cellulaire, au contrôle de la prolifération et à l’intégrité du génome. Une dérégulation de l’ubiquitination dépendante d’Elongin BC a été impliquée dans la signalisation oncogénique et des réponses à l’hypoxie altérées, faisant d’ELOB un nœud pertinent pour des études mécanistiques des réseaux de dégradation des protéines.

Elongin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ELOB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Elongin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ELOB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ELOB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Elongin B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ELOB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Elongin B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Elongin B dans les cellules tumorales présentant une expression de ELOB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.