elafin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401832-ACT

PI3 kodiert Elafin, einen sezernierten Serinprotease-Inhibitor (auch als Peptidase-Inhibitor 3 bekannt), der neutrophile Elastase und verwandte Proteasen hemmt, um während Entzündungen die Integrität der epithelialen Barriere zu erhalten. Elafin ist an der mukosalen angeborenen Immunität und am Gewebeumbau beteiligt, indem es proteasegetriebene Degradation der extrazellulären Matrix begrenzt und zytokinreiche Mikroumgebungen moduliert. Seine Expression wird als Reaktion auf entzündliche Signale in Epithelien der Atemwege, der Haut und des Gastrointestinaltrakts dynamisch reguliert und verknüpft PI3 mit Prozessen wie Wundheilung und Wirtsabwehr. Fehlregulierte PI3-/Elafin-Spiegel wurden mit chronisch-entzündlichen Erkrankungen und dem in zahlreichen epithelialen Krankheitskontexten beobachteten Protease–Antiprotease-Ungleichgewicht in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz als mechanistischen Marker in der Immunologie- und Barrierebiologie-Forschung unterstützt.

elafin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PI3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

elafin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PI3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PI3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen elafin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PI3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von elafin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des elafin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PI3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.