Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF4AIII: sc-402660-ACT

EIF4A3 code eIF4AIII, une hélicase ARN de type DEAD-box qui constitue un composant central du complexe de jonction des exons (EJC) déposé sur les ARNm épissés. eIF4AIII coordonne la régulation génique post-transcriptionnelle en couplant l’épissage du pré-ARNm à l’export, à la localisation, au contrôle de la traduction et à la dégradation des ARNm médiée par codon stop prématuré (NMD), contribuant ainsi à la fidélité du transcriptome et à la protéostasie. Par ses rôles dans la surveillance des ARN et le contrôle qualité dépendant de l’épissage, EIF4A3 influence des voies liées à la progression du cycle cellulaire, au maintien du génome et aux réponses au stress. La dérégulation de l’activité de l’EJC et de la NMD a été associée à une utilisation aberrante des isoformes et à une expression altérée de réseaux géniques oncogéniques et neurodéveloppementaux, faisant d’EIF4A3 un nœud pertinent pour des études mécanistiques des défauts de maturation des ARN.

eIF4AIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF4A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF4AIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF4A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF4A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF4AIII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF4A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF4AIII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF4AIII dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF4A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.