Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF3γ: sc-418339-ACT

EIF3H code la sous-unité gamma du facteur eucaryote d’initiation de la traduction 3 (eIF3γ), un composant central du complexe eIF3 qui coordonne le recrutement de la sous-unité ribosomique 40S, le chargement de l’ARNm et la reconnaissance du codon d’initiation lors de l’initiation de la traduction dépendante de la coiffe. En régulant la synthèse protéique à l’échelle globale et de manière sélective selon les transcrits, eIF3γ influence la croissance cellulaire, les réponses au stress et la protéostasie, en s’articulant avec des voies telles que la signalisation mTOR et les programmes de réponse intégrée au stress qui ajustent la production traductionnelle. Une altération de la fonction du complexe eIF3 a été associée à un contrôle de la traduction dérégulé observé dans des états cellulaires prolifératifs et adaptés au stress, ce qui justifie l’étude d’EIF3H dans des modèles pertinents pour les maladies où la reprogrammation traductionnelle contribue au phénotype.

eIF3γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF3H sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF3γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF3H dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF3H, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF3γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF3H natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF3γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF3γ dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF3H silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.