Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF2Bβ: sc-404686-ACT

EIF2B2 code la sous-unité β du facteur eucaryote d’initiation de la traduction 2B (eIF2B), le facteur d’échange de nucléotides guanyliques qui régénère eIF2–GTP actif et soutient ainsi la synthèse protéique globale. eIF2B constitue un nœud central du contrôle traductionnel en aval de la réponse intégrée au stress (ISR), où la phosphorylation d’eIF2α réduit l’activité d’eIF2B afin de reprogrammer la traduction lors du stress du réticulum endoplasmique, de la restriction en nutriments, ainsi que d’agressions virales ou oxydatives. Par cette régulation, EIF2B2 contribue à la protéostasie, à l’expression génique adaptative au stress et aux décisions de destinée cellulaire liées à la prolifération et à la survie. Des dysfonctionnements des composants du complexe eIF2B sont associés à des troubles du spectre des leucodystrophies et ont été étudiés dans le contexte de la signalisation du stress, de l’homéostasie neurogliale et de la dérégulation de la traduction.

eIF2Bβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF2B2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF2Bβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF2B2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF2B2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF2Bβ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF2B2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF2Bβ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF2Bβ dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF2B2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.