Plasmide CRISPR d'Activation (h) EDG-7: sc-404930-ACT

LPAR3 (EDG-7) code un récepteur couplé aux protéines G pour l’acide lysophosphatidique, qui se couple principalement aux voies de signalisation Gαi/Gαq afin de réguler la mobilisation du calcium intracellulaire, le remodelage du cytosquelette dépendant de Rho/ROCK et l’activation de la voie MAPK/ERK. Par l’intermédiaire de ces voies, EDG-7 influence la migration cellulaire, la dynamique d’adhérence, les programmes de prolifération et la signalisation inflammatoire dans divers types cellulaires humains. Une activité altérée de l’axe LPA–LPAR a été associée à des phénotypes liés au cancer, à la fibrose ainsi qu’à une dysrégulation vasculaire et immunitaire, faisant de LPAR3 un nœud utile pour disséquer les réseaux de signalisation des médiateurs lipidiques. EDG-7 fournit ainsi un point d’entrée mécanistique pour étudier comment des signaux lipidiques extracellulaires reprogramment les réponses transcriptionnelles et la signalisation proximale à la membrane.

EDG-7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LPAR3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EDG-7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LPAR3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LPAR3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EDG-7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LPAR3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EDG-7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EDG-7 dans les cellules tumorales présentant une expression de LPAR3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.