Plasmide CRISPR d'Activation (m) DRP1: sc-428678-ACT

Le gène murin Dnm1l code la protéine 1 apparentée à la dynamine (DRP1), une grande GTPase qui orchestre la fission des mitochondries et des peroxysomes en s’assemblant sur les membranes des organites et en les constrictant de manière dépendante du GTP. DRP1 intègre des signaux issus de la phosphorylation, de la SUMOylation et de l’ubiquitination afin de coupler la dynamique de fission à l’état énergétique cellulaire, à l’homéostasie du Ca2+ et à la gestion des espèces réactives de l’oxygène. Par son rôle central dans le remodelage du réseau mitochondrial, DRP1 influence la mitophagie, la sensibilité à l’apoptose et la progression du cycle cellulaire, rendant la régulation de Dnm1l particulièrement pertinente pour les études sur la neurodégénérescence, le stress cardiométabolique, l’inflammation et l’adaptation des cellules cancéreuses. Des perturbations de l’activité de DRP1 sont fréquemment associées à une bioénergétique altérée et à des voies de contrôle qualité des organites, notamment la mitophagie liée à PINK1/Parkin et la signalisation des kinases activées par le stress.

DRP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Dnm1l sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DRP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Dnm1l dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Dnm1l, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DRP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Dnm1l natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DRP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DRP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Dnm1l silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.