Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dnmt1: sc-400272-ACT

DNMT1 code la DNA (cytosine-5)-méthyltransférase 1 (Dnmt1), la principale méthyltransférase de maintenance, qui recopie les profils de méthylation des CpG sur les brins d’ADN néosynthétisés pendant la phase S. Grâce à ses interactions avec UHRF1, PCNA et la machinerie de la chromatine couplée à la réplication, Dnmt1 préserve la mémoire épigénétique et soutient la stabilité du génome, l’empreinte génomique et l’inactivation du chromosome X. L’activité de DNMT1 façonne les programmes transcriptionnels via un dialogue avec les modifications des histones et le remodelage de la chromatine, influençant l’identité cellulaire et la différenciation. Une fonction de DNMT1 dérégulée et une méthylation aberrante de l’ADN sont associées à une reprogrammation épigénétique oncogénique, à des réponses de réparation de l’ADN altérées et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui en fait une cible centrale pour les études mécanistiques du maintien de l’épigénome.

Dnmt1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DNMT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dnmt1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DNMT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DNMT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dnmt1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DNMT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dnmt1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dnmt1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DNMT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.