Plasmide CRISPR d'Activation (m) DNA-PK_CS: sc-422405-ACT

Prkdc code la sous-unité catalytique de la protéine kinase dépendante de l’ADN, DNA-PKCS, un régulateur central de la réparation des cassures double brin de l’ADN par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ). DNA-PKCS forme une holoenzyme active avec le complexe Ku70/Ku80 afin de coordonner la reconnaissance des extrémités, la synapsis, le traitement des extrémités et la ligature, et s’interface avec la signalisation ATM/ATR pour moduler les réponses de checkpoint après un stress génotoxique. Dans les cellules murines, l’activité de Prkdc est également indispensable à la recombinaison V(D)J au cours du développement lymphocytaire, reliant cette kinase à la stabilité du génome et à la maturation du système immunitaire. La perturbation des voies de réparation dépendantes de DNA-PKCS est largement utilisée pour modéliser la radiosensibilité, l’instabilité chromosomique et des défauts de réparation de l’ADN pertinents pour la biologie du cancer et la recherche sur les immunodéficiences.

DNA-PKCS Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Prkdc sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA-PKCS Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Prkdc dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Prkdc, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA-PKCS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Prkdc natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA-PKCS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA-PKCS dans les cellules tumorales présentant une expression de Prkdc silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.