Plasmide CRISPR d'Activation (h) DMPK: sc-402727-ACT

Le DMPK humain (dystrophia myotonica protein kinase) code une kinase sérine/thréonine enrichie dans le muscle et impliquée dans l’organisation du cytosquelette, l’adhésion cellulaire et la régulation de la différenciation myogénique. L’activité de DMPK s’inscrit à l’interface de la dynamique actine–myosine et de réseaux de signalisation coordonnant l’excitabilité musculaire et l’intégrité structurelle, soutenant des processus tels que la contraction et le remodelage cellulaire. Une expansion pathogène de répétitions CTG au locus DMPK est génétiquement associée à la dystrophie myotonique de type 1, où une dérégulation médiée par l’ARN contribue à des effets étendus sur l’épissage alternatif et la fonction musculaire. Ces caractéristiques font de DMPK une cible pertinente pour étudier la signalisation des kinases en biologie musculaire, la physiopathologie neuromusculaire et la régulation transcriptionnelle au niveau de loci associés à la maladie.

DMPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DMPK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DMPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DMPK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DMPK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DMPK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DMPK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DMPK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DMPK dans les cellules tumorales présentant une expression de DMPK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.