Plasmide CRISPR d'Activation (h) Derlin-1: sc-404762-ACT

DERL1 code la dérline‑1, un composant membranaire du réticulum endoplasmique (RE) de la machinerie de dégradation associée au RE (ERAD), qui facilite la rétrotranslocation des protéines mal repliées de la lumière du RE ainsi que des protéines membranaires vers le cytosol, où elles sont éliminées par le système ubiquitine‑protéasome. La dérline‑1 participe au contrôle de la protéostase en conditions basales et lors du stress du RE, en interagissant avec des voies de contrôle qualité telles que la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et la dégradation des glycoprotéines aberrantes. En régulant l’élimination des protéines mal repliées ou non assemblées, DERL1 influence l’adaptation cellulaire à la charge sécrétoire, au déséquilibre rédox et au stress protéotoxique. Des altérations de l’expression de DERL1 ont été rapportées dans de multiples contextes pathologiques caractérisés par un stress chronique du RE et une homéostasie protéique dérégulée, ce qui étaye son intérêt en tant que nœud mécanistique pour étudier la signalisation du stress et l’élimination couplée au protéasome.

Derlin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DERL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Derlin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DERL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DERL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Derlin-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DERL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Derlin-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Derlin-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DERL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.