Plasmide CRISPR d'Activation (h) DENND5B: sc-414817-ACT

DENND5B code une protéine contenant un domaine DENN impliquée dans la régulation du trafic membranaire dépendant des GTPases Rab, contribuant à coordonner le bourgeonnement des vésicules, le transport endosomal et la signalisation compartimentée. En influençant le cycle des petites GTPases et le tri du cargo, DENND5B peut affecter le renouvellement des récepteurs, la localisation intracellulaire des protéines et des processus cellulaires plus larges tels que la polarité et la prolifération. Une expression altérée ou la perturbation de régulateurs du trafic comme DENND5B a été associée à une dérégulation des réseaux de signalisation ainsi qu’à des changements génomiques/fonctionnels observés dans divers contextes de maladies humaines, notamment des phénotypes liés au cancer. Par conséquent, DENND5B est fréquemment étudiée dans des voies reliant la dynamique des endomembranes au contrôle de l’état cellulaire et à l’adaptation au stress.

DENND5B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DENND5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DENND5B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DENND5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DENND5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DENND5B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DENND5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DENND5B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DENND5B dans les cellules tumorales présentant une expression de DENND5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.