Plasmide CRISPR d'Activation (h) dendrin: sc-404856-ACT

Le gène humain DDN code la dendrine, une protéine associée à la densité postsynaptique, enrichie dans les neurones et impliquée dans l’organisation de complexes de signalisation synaptique. La dendrine participe au remodelage, dépendant de l’activité, des épines dendritiques et est liée à la régulation du cytosquelette ainsi qu’à des interactions protéine–protéine qui façonnent la plasticité synaptique. Au-delà du SNC, la dendrine a été étudiée dans les podocytes glomérulaires, où elle se localise dans des compartiments associés au diaphragme de fente et a été reliée à des voies influençant la structure cellulaire et les réponses au stress. La dérégulation de l’expression ou de la localisation de la dendrine a été explorée dans le contexte de phénotypes neuropsychiatriques et de processus associés aux lésions rénales, ce qui étaye son intérêt comme cible de recherche pour comprendre les mécanismes de l’intégrité des synapses et de la barrière de filtration.

dendrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

dendrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de dendrin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de dendrin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie dendrin dans les cellules tumorales présentant une expression de DDN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.