Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDAH II: sc-403032-ACT

Le gène humain **DDAH2** code la diméthylarginine diméthylaminohydrolase II (DDAH II), une enzyme cytosolique qui hydrolyse la diméthylarginine asymétrique (ADMA) et la L‑NMMA en citrulline et diméthylamine, régulant ainsi l’activité de la synthase de l’oxyde nitrique et la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO). En contrôlant le métabolisme des méthylarginines, DDAH II s’intègre aux voies de signalisation endothéliales, aux processus sensibles à l’état rédox et aux mécanismes d’homéostasie vasculaire qui influencent le tonus du muscle lisse et la signalisation inflammatoire. Des altérations de l’expression ou de l’activité de DDAH2 ont été associées à une perturbation de la signalisation du NO et à des phénotypes de dysfonction endothéliale. Ces mécanismes font de DDAH2 une cible pertinente pour l’étude des réponses au stress cardiométabolique, de l’inflammation vasculaire et des programmes cellulaires dépendants du NO dans des systèmes modèles humains.

DDAH II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDAH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDAH II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDAH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDAH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDAH II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDAH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDAH II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDAH II dans les cellules tumorales présentant une expression de DDAH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.