Plasmide CRISPR d'Activation (h) DD4: sc-403692-ACT

AKR1C4 humain code DD4, une aldédo-céto réductase dépendante du NADPH qui catalyse la réduction des hormones stéroïdiennes et de substrats carbonylés réactifs. DD4 joue un rôle majeur dans le métabolisme hépatique des stéroïdes et des acides biliaires, contribuant à la détoxification et à l’homéostasie redox via la régulation de l’interconversion des cétostéroïdes. En modulant les niveaux d’androgènes, de progestatifs et d’autres intermédiaires stéroïdiens, AKR1C4 influence des programmes transcriptionnels dépendants des hormones ainsi que des réseaux de signalisation métabolique. Une expression ou une activité altérée d’AKR1C4 a été associée à une dérégulation du métabolisme des stéroïdes et à des pathologies hépatiques, ce qui souligne sa pertinence pour l’étude de la biologie des maladies métaboliques et des réponses aux xénobiotiques.

DD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AKR1C4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AKR1C4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AKR1C4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DD4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AKR1C4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DD4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DD4 dans les cellules tumorales présentant une expression de AKR1C4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.