Plasmide CRISPR d'Activation (h) DBH: sc-402441-ACT

La dopamine bêta-hydroxylase (DBH) code une monooxygénase dépendante du cuivre qui catalyse la conversion de la dopamine en noradrénaline, une étape clé de la biosynthèse des catécholamines dans les neurones sympathiques et les cellules chromaffines de la médullosurrénale. L’activité de la DBH soutient le métabolisme vésiculaire des neurotransmetteurs et s’intègre aux voies pilotées par la tyrosine hydroxylase qui régulent la signalisation adrénergique, les réponses neuroendocrines au stress et l’homéostasie cardiovasculaire. Une expression ou une fonction enzymatique altérée de la DBH a été associée à une dérégulation des niveaux de noradrénaline et est étudiée dans le contexte de traits neuropsychiatriques et de dysfonctionnements du système nerveux autonome. En tant qu’indicateur moléculaire de l’état catécholaminergique, la DBH est largement utilisée pour explorer l’identité de la lignée noradrénergique, la maturation neuronale et le remodelage des neurotransmetteurs dépendant des stimuli.

DBH Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DBH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DBH Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DBH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DBH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DBH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DBH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DBH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DBH dans les cellules tumorales présentant une expression de DBH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.