Plasmide CRISPR d'Activation (h) DARPP-32: sc-400430-ACT

PPP1R1B code DARPP-32 (phosphoprotéine de 32 kDa régulée par la dopamine et l’AMPc), un intégrateur central des signalisations dopaminergique et glutamatergique dans les neurones. Lorsqu’elle est phosphorylée par la PKA, DARPP-32 inhibe la protéine phosphatase 1, modulant ainsi les états de phosphorylation en aval qui façonnent la plasticité synaptique, les réponses transcriptionnelles et l’excitabilité neuronale. Cette régulation relie PPP1R1B aux voies de signalisation AMPc/PKA, aux voies dépendantes du calcium et aux réseaux de phosphorylation induits par les récepteurs dans les neurones épineux moyens du striatum. Des altérations de l’expression ou de la phosphorylation de DARPP-32 sont fréquemment étudiées dans le cadre des mécanismes des maladies neuropsychiatriques et neurodégénératives, ainsi que des modifications de la transduction du signal en biologie tumorale.

DARPP-32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DARPP-32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DARPP-32. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DARPP-32 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DARPP-32 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.