Plasmide CRISPR d'Activation (h) DAGLα: sc-402826-ACT

DAGLA code la lipase α des diacylglycérols (DAGLα), une hydrolase à sérine associée aux membranes qui convertit le sn-1-acyl-2-arachidonoyl glycérol en 2-arachidonoylglycérol (2‑AG), un important médiateur lipidique endocannabinoïde. En contrôlant la production de 2‑AG aux synapses et dans d’autres microdomaines de signalisation, DAGLα régule la signalisation cannabinoïde rétrograde via les récepteurs CB1/CB2 et s’intègre aux voies dépendantes des phosphoinositides et du diacylglycérol. Cette enzyme influence l’excitabilité neuronale, la plasticité synaptique et la signalisation neuro-inflammatoire, et une altération du tonus endocannabinoïde a été associée à de multiples contextes de maladies neurologiques et neuropsychiatriques. L’activité de DAGLα recoupe également des réseaux lipidiques dérivés de l’acide arachidonique, faisant de DAGLA un nœud utile pour étudier l’homéostasie de la signalisation lipidique et la transduction du signal couplée à des stimuli.

DAGLα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DAGLA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DAGLα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DAGLA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DAGLA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DAGLα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DAGLA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DAGLα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DAGLα dans les cellules tumorales présentant une expression de DAGLA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.