Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dab2: sc-400979-ACT

Disabled homolog 2 (DAB2) code Dab2, une protéine adaptatrice de l’endocytose qui couple l’internalisation médiée par la clathrine au trafic des récepteurs et à l’atténuation des signaux. Dab2 participe à des voies qui régulent la signalisation TGF-β, la modulation de Wnt/β-caténine, ainsi que l’adhérence et la migration cellulaires dépendantes des intégrines, en organisant des complexes protéiques à proximité de la membrane. Par ses effets sur la polarité épithéliale, les programmes de différenciation et le renouvellement des récepteurs aux facteurs de croissance, une expression altérée de DAB2 a été associée à des phénotypes de progression tumorale et à des comportements cellulaires liés aux métastases dans de multiples contextes tissulaires. Dab2 contribue également à des processus plus larges de transport vésiculaire qui influencent la réactivité cellulaire aux signaux extracellulaires.

Dab2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DAB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dab2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DAB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DAB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dab2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DAB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dab2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dab2 dans les cellules tumorales présentant une expression de DAB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.