DAAO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402772-ACT

Il gene umano **DAO** codifica la **D-amminoacido ossidasi (DAAO)**, una flavoproteina perossisomiale che catalizza la deaminazione ossidativa di D-amminoacidi neutri, generando i corrispondenti acidi imminici, perossido di idrogeno e ammoniaca. Regolando i livelli di D-serina e di metaboliti correlati, la DAAO influenza la disponibilità del co-agonista dei recettori NMDA e collega il metabolismo degli amminoacidi all’equilibrio redox attraverso la gestione delle specie reattive dell’ossigeno associate ai perossisomi. Questo asse si interseca con la neurotrasmissione, le risposte cellulari allo stress ossidativo e l’omeostasi metabolica nel cervello e nei tessuti periferici. Alterazioni dell’attività o dell’espressione della DAAO sono state studiate nel contesto della biologia delle malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative, nonché in modelli più ampi di danno ossidativo e disfunzione metabolica.

DAAO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DAO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DAAO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DAO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DAO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DAAO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DAO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DAAO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DAAO nelle cellule tumorali con espressione di DAO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.