Plasmide CRISPR d'Activation (h) cystatin D: sc-405049-ACT

CST5 code la cystatine D, une cystatine de type 2 sécrétée qui inhibe les protéases à cystéine de type papaïne, telles que les cathepsines, contribuant ainsi à réguler la protéolyse extracellulaire et intracellulaire. En modulant l’activité des protéases, la cystatine D participe à l’homéostasie épithéliale, au remodelage de la matrice extracellulaire, au traitement des antigènes et à la signalisation inflammatoire pouvant influencer la différenciation cellulaire et la fonction de barrière. Une expression altérée de CST5 ainsi qu’un déséquilibre cathepsines–cystatines ont été rapportés dans des contextes de biologie tumorale, d’inflammation des muqueuses et de remodelage tissulaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la protéostasie et de la régulation du microenvironnement. En tant que protéine humaine exprimée dans plusieurs compartiments épithéliaux, la cystatine D est fréquemment étudiée dans des voies contrôlant la protéolyse associée à l’invasion et des programmes transcriptionnels induits par le stress.

cystatin D Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CST5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cystatin D Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CST5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CST5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cystatin D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CST5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cystatin D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cystatin D dans les cellules tumorales présentant une expression de CST5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.