Plasmide CRISPR d'Activation (h) CyPA: sc-418155-ACT

Le gène humain PPIA code la cyclophiline A (CyPA), une peptidyl-prolyl cis-trans isomérase ubiquitaire qui accélère le repliement des protéines et les changements conformationnels dans le cytosol et le noyau. CyPA participe à la protéostasie, aux réseaux de chaperons et à la signalisation induite par le stress, et son interaction avec des protéines cibles peut influencer les programmes transcriptionnels, l’apoptose et les réponses inflammatoires. L’axe PPIA/CyPA a été associé à la modulation de la signalisation immunitaire et des interactions hôte–pathogène, et des altérations de son expression ou de son activité sont fréquemment étudiées en biologie du cancer, dans l’inflammation cardiovasculaire et dans des contextes de neuro-inflammation. En tant que protéine carrefour cellulaire, CyPA est couramment utilisée pour explorer les voies régissant le trafic des protéines, l’adaptation au stress et au redox, ainsi que l’assemblage des complexes de signalisation.

CyPA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPIA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CyPA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPIA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPIA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CyPA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPIA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CyPA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CyPA dans les cellules tumorales présentant une expression de PPIA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.