Plasmide CRISPR d'Activation (h) cyclin B2: sc-402434-ACT

CCNB2 code la cycline B2, une sous-unité régulatrice essentielle du complexe CDK1 qui favorise la transition G2/M et la progression mitotique. La cycline B2 contribue à l’activation en temps voulu des programmes d’entrée en mitose, à la coordination de la dynamique des centrosomes et à la fidélité de la ségrégation des chromosomes via le contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire. Son expression est strictement régulée par une protéolyse dépendante de l’ubiquitine via l’APC/C afin d’assurer une sortie de mitose ordonnée. Une activité ou une expression dérégulée de CCNB2 est fréquemment associée à des phénotypes prolifératifs et à une instabilité du cycle cellulaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des signalisations oncogéniques et du maintien du génome.

cyclin B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCNB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cyclin B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCNB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCNB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cyclin B2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCNB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cyclin B2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cyclin B2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCNB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.