connexin 43 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400241-ACT

GJA1 codifica a conexina 43 (Cx43), uma importante proteína de junções comunicantes (gap junctions) que se organiza em hemicanais e canais intercelulares para mediar a troca direta, célula a célula, de íons e pequenos metabólitos. Ao regular o acoplamento elétrico, a sinalização de cálcio e a difusão de segundos mensageiros, a Cx43 influencia a homeostase tecidual, a contração coordenada, o reparo de feridas e o padrão de desenvolvimento. A função da conexina 43 integra-se às redes de adesão e do citoesqueleto e é modulada por tráfego e renovação dependentes de fosforilação. Alterações na expressão de GJA1 ou no gating (abertura/fechamento) dos canais de conexina 43 estão associadas à comunicação intercelular prejudicada em distúrbios de condução cardíaca, neuroinflamação e invasividade de células cancerígenas, tornando-a um alvo frequente em estudos de sinalização celular e mecanismos de doença.

connexin 43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GJA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

connexin 43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GJA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GJA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de connexin 43. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GJA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de connexin 43 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via connexin 43 em células tumorais com expressão de GJA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.