Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL8A2: sc-403831-ACT

COL8A2 code la chaîne alpha 2 du collagène de type VIII, un collagène non fibrillaire à chaîne courte qui contribue à l’organisation de la matrice extracellulaire et aux structures associées à la membrane basale. Dans les tissus oculaires, il est particulièrement enrichi dans l’endothélium cornéen et la membrane de Descemet, où il soutient l’assemblage matriciel, l’adhésion cellulaire et l’intégrité biomécanique. Le remodelage matriciel associé à COL8A2 s’articule avec des voies qui régissent la signalisation cellule–matrice, notamment l’adhésion médiée par les intégrines et le renouvellement de la matrice extracellulaire. Des variations génétiques ou une expression dérégulée de COL8A2 ont été associées à des dystrophies endothéliales cornéennes, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’homéostasie de la matrice extracellulaire et de la fonction des cellules endothéliales.

COL8A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL8A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL8A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL8A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL8A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL8A2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL8A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL8A2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL8A2 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL8A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.