COL1A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400064-ACT

COL1A1 codifica la catena pro-α1 del collagene di tipo I, un importante componente fibrillare della matrice extracellulare che si assembla in eterotrimeri e conferisce resistenza alla trazione ai tessuti connettivi. La sua biosintesi comprende processi nel reticolo endoplasmatico (RE), l’idrossilazione di prolina e lisina, la formazione della tripla elica, la secrezione e la reticolazione extracellulare, integrandosi con l’organizzazione della ECM, la segnalazione delle adesioni focali e i programmi fibrogenici guidati da TGF-β. L’espressione di COL1A1 è finemente regolata durante la riparazione delle ferite e il rimodellamento stromale ed è spesso utilizzata come indicatore dell’attivazione dei fibroblasti e della deposizione di matrice. Una deregolazione di COL1A1 contribuisce alla fibrosi patologica e alla desmoplasia associata ai tumori, e difetti germinali del collagene di tipo I sono collegati a patologie ereditarie del tessuto connettivo.

COL1A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL1A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL1A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL1A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL1A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL1A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL1A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL1A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL1A1 nelle cellule tumorali con espressione di COL1A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.