Plasmide CRISPR d'Activation (h) CNTF: sc-402471-ACT

Le CNTF humain (ciliary neurotrophic factor, facteur neurotrophique ciliaire) est une cytokine sécrétée de la famille de l’IL-6 qui favorise la survie neuronale, la différenciation et les réponses au stress dans les systèmes nerveux central et périphérique. Le CNTF transmet son signal principalement via le complexe récepteur CNTFRα/LIFR/gp130 afin d’activer les voies JAK/STAT, avec une implication supplémentaire des voies MAPK/ERK et PI3K/AKT, qui influencent la croissance des neurites, la biologie gliale et le dialogue inflammatoire. Des altérations de l’expression du CNTF et de l’activité de cette voie ont été étudiées dans la neurodégénérescence, les lésions rétiniennes et les contextes de démyélinisation ou de neuropathie, où le soutien trophique et la gliose réactive modèlent des phénotypes associés à la maladie. Des modèles in vitro et in vivo utilisent la modulation du CNTF pour explorer les programmes de neuroprotection, les interactions neurone–glie et les réseaux transcriptionnels liés à la régénération et au stress métabolique.

CNTF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CNTF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CNTF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CNTF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CNTF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CNTF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CNTF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CNTF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CNTF dans les cellules tumorales présentant une expression de CNTF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.