Plasmide CRISPR d'Activation (h) CIN85: sc-402573-ACT

SH3KBP1 code pour CIN85, une protéine adaptatrice multidomaine qui coordonne des interactions protéine–protéine via des domaines SH3 afin de réguler le trafic et l’endocytose des récepteurs à activité tyrosine kinase. CIN85 participe à l’atténuation de la signalisation d’EGFR et de c-Met, à l’internalisation médiée par la clathrine et à l’assemblage de complexes de tri dépendants de l’ubiquitine grâce à des interactions avec CBL et la machinerie endocytaire. Par ces voies, elle influence le remodelage du cytosquelette, la migration cellulaire et la durée des signaux au sein de réseaux liés à MAPK et PI3K. Une dérégulation du trafic et de la dynamique de signalisation associés à CIN85 a été impliquée, dans la biologie des maladies humaines, dans des contextes de prolifération aberrante, d’invasion et d’altération de la signalisation des cellules immunitaires.

CIN85 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SH3KBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CIN85 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SH3KBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SH3KBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CIN85. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SH3KBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CIN85 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CIN85 dans les cellules tumorales présentant une expression de SH3KBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.