Plasmide CRISPR d'Activation (h) CHIP/STUB1: sc-400815-ACT

STUB1 code pour l’E3 ubiquitine‑ligase CHIP, un co‑chaperon qui couple la reconnaissance des clients de HSP70/HSP90 au renouvellement des protéines dépendant de l’ubiquitine via ses domaines à répétitions tétratricopeptidiques (TPR) et U‑box. CHIP/STUB1 régule la protéostasie en coordonnant le contrôle qualité des protéines, les décisions de repliement médiées par les chaperons et la dégradation via le système ubiquitine–protéasome, avec des effets en aval sur les réponses cellulaires au stress ainsi que sur l’homéostasie mitochondriale et du réticulum endoplasmique (RE). Par ces processus, STUB1 influence des voies liées à l’agrégation protéique et au maintien neuronal, et une activité altérée de CHIP/STUB1 a été associée à des phénotypes de neurodégénérescence et à des mécanismes pathogéniques liés à l’ataxie. Son rôle central dans le contrôle de la charge en protéines mal repliées fait de STUB1 un nœud pertinent pour étudier la signalisation du stress et la stabilité du protéome dans des modèles de cellules humaines.

CHIP/STUB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STUB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CHIP/STUB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STUB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STUB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CHIP/STUB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STUB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CHIP/STUB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CHIP/STUB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de STUB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.