Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD8-α: sc-400372-ACT

CD8A code la chaîne CD8-α, une glycoprotéine transmembranaire de type I qui forme des homodimères CD8αα ou des hétérodimères CD8αβ à la surface des lymphocytes T cytotoxiques et de certains sous-ensembles de lymphocytes T « innés-like ». CD8-α agit comme co-récepteur de la signalisation du TCR restreinte au CMH de classe I en se liant au CMH I et en recrutant LCK vers le complexe CD3, amplifiant ainsi l’activation dépendante de l’antigène, la différenciation cytolytique et la production de cytokines. Par ce rôle, CD8A est associé à des voies qui régissent la formation de la synapse immunologique, la programmation effectrice des lymphocytes T et les réponses inflammatoires induites par les interférons. Des modifications de l’expression de CD8A et des états fonctionnels des lymphocytes T CD8+ sont largement utilisées comme indicateurs de l’infiltration immunitaire et de la dysfonction dans les infections chroniques, l’auto-immunité et la modulation immunitaire associée aux tumeurs.

CD8-α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CD8A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD8-α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CD8A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CD8A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD8-α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CD8A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD8-α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD8-α dans les cellules tumorales présentant une expression de CD8A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.