Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD40: sc-400524-ACT

Le CD40 humain code un récepteur co‑stimulatoire de la superfamille des récepteurs du TNF, exprimé principalement sur les cellules présentatrices d’antigène, notamment les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les macrophages, où il intègre les signaux de CD40L afin de façonner l’immunité adaptative. L’engagement de CD40 active les voies de signalisation NF‑κB canonique et non canonique, les voies MAPK et des programmes dépendants de PI3K/AKT qui régulent la présentation de l’antigène, la production de cytokines, la survie, ainsi que la prolifération des lymphocytes B et la commutation isotypique (recombinaison de changement de classe). Par ces voies, CD40 influence la dynamique des centres germinatifs et les réponses humorales dépendantes des lymphocytes T, et une activité altérée de CD40 a été associée à une dysrégulation immunitaire et à une physiopathologie inflammatoire. Une signalisation CD40 dérégulée est également pertinente en immunologie des tumeurs et dans la recherche sur les hémopathies malignes B, en raison de son rôle dans les états d’activation cellulaire et la communication avec le microenvironnement.

CD40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CD40 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CD40 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CD40, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD40. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CD40 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD40 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD40 dans les cellules tumorales présentant une expression de CD40 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.