Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD39L4: sc-410720-ACT

L’ENTPD5 humain code CD39L4, une ectonucléoside triphosphate diphosphohydrolase localisée dans le réticulum endoplasmique, qui hydrolyse l’UDP et le GDP en monophosphates, contribuant ainsi à l’homéostasie des sucres nucléotidiques et au contrôle qualité des glycoprotéines. En maintenant le cycle de repliement calnexine/calréticuline dépendant de l’UDP‑glucose, CD39L4 influence le traitement des protéines dans le RE, la N‑glycosylation et les programmes de protéostase liés à la sécrétion et à la maturation des récepteurs membranaires. L’activité d’ENTPD5 s’articule avec la signalisation du stress du RE et le remodelage métabolique via ses effets sur la demande en repliement protéique et sur le trafic dépendant des glycannes. Une expression dérégulée d’ENTPD5 a été associée à des phénotypes de glycosylation altérés et à des voies liées à la prolifération en biologie du cancer, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’homéostasie du RE et des réseaux de signalisation oncogéniques.

CD39L4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ENTPD5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD39L4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ENTPD5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ENTPD5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD39L4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ENTPD5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD39L4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD39L4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ENTPD5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.