Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD223: sc-406616-ACT

LAG3 (CD223) est un récepteur inhibiteur de point de contrôle immunitaire exprimé principalement par les lymphocytes T activés, les lymphocytes T régulateurs, les cellules NK et certains sous-types de cellules dendritiques, où il module l’activation induite par l’antigène et la fonction effectrice. En se liant au CMH de classe II et à des ligands apparentés, CD223 atténue la signalisation du TCR et contribue à la tolérance périphérique, aux programmes d’épuisement des lymphocytes T et à la régulation de la production de cytokines. L’activité de LAG3 s’entrecroise avec des voies qui régissent l’organisation de la synapse immunologique, les réseaux de co-stimulation/points de contrôle et les états transcriptionnels inflammatoires. Une signalisation dérégulée de CD223 a été impliquée dans l’épuisement immunitaire associé aux infections chroniques, dans des contextes d’échappement tumoral au système immunitaire et dans l’inflammation auto-immune, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en immunologie.

CD223 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LAG3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD223 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LAG3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LAG3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD223. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LAG3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD223 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD223 dans les cellules tumorales présentant une expression de LAG3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.