Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD154: sc-401682-ACT

CD40LG code pour CD154 (ligand de CD40), une protéine transmembranaire de type II exprimée transitoirement à la surface des lymphocytes T CD4+ activés et d’autres sous-populations immunitaires. Elle fournit des signaux co-stimulateurs essentiels aux lymphocytes B, aux cellules dendritiques et aux macrophages exprimant CD40. L’interaction CD154–CD40 favorise la formation des centres germinatifs, la recombinaison de commutation de classe des immunoglobulines et la « licence » des cellules dendritiques, en intégrant la présentation de l’antigène à la polarisation de la réponse immunitaire adaptative. La signalisation en aval implique une activation dépendante des TRAF des voies NF-κB, MAPK et PI3K, qui régulent la production de cytokines, la survie et la différenciation. Une activité dérégulée de CD40LG/CD154 est associée à des altérations de l’immunité humorale et à des phénotypes immunitaires inflammatoires, ce qui souligne sa pertinence dans l’étude de la régulation immunitaire et des mécanismes liés à l’auto-immunité.

CD154 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CD40LG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD154 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CD40LG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CD40LG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD154. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CD40LG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD154 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD154 dans les cellules tumorales présentant une expression de CD40LG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.