Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCK-AR: sc-402419-ACT

Le gène humain **CCKAR** code le récepteur A de la cholécystokinine (**CCK-AR**), un RCPG de classe A activé par des peptides de cholécystokinine, qui régule la signalisation associée à la digestion ainsi que les signaux de satiété induits par les nutriments. Après liaison du ligand, CCK-AR active des voies de protéines G qui modulent le calcium intracellulaire et des cascades de kinases en aval, coordonnant les réponses sécrétoires et la contractilité du muscle lisse dans les tissus gastro-intestinaux. L’activité de CCKAR s’inscrit aussi dans la communication neuroendocrinienne entre l’intestin et le cerveau et influence des programmes cellulaires liés au métabolisme et à l’équilibre énergétique. Une signalisation CCKAR dérégulée a été étudiée dans le contexte de phénotypes métaboliques et d’altérations fonctionnelles gastro-intestinales, ce qui étaye sa pertinence pour des études mécanistiques de la transduction du signal médiée par les récepteurs.

CCK-AR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCKAR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCK-AR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCKAR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCKAR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCK-AR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCKAR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCK-AR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCK-AR dans les cellules tumorales présentant une expression de CCKAR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.