Plásmido CRISPR de Activación (h) cathepsin K: sc-400673-ACT

CTSK codifica la catepsina K, una proteasa cisteínica lisosomal con elevada actividad colagenolítica y elastolítica que favorece el recambio de la matriz extracelular y la remodelación tisular. En los osteoclastos, la catepsina K actúa dentro de la laguna de resorción para degradar el colágeno tipo I y otras proteínas de la matriz ósea, vinculando a CTSK con las vías que regulan la diferenciación de osteoclastos, la proteólisis dependiente de la acidificación y la homeostasis ósea. Más allá de la biología esquelética, la actividad de CTSK se ha implicado en la remodelación de la matriz mediada por macrófagos y en microambientes inflamatorios donde el equilibrio de proteasas influye en la migración celular y la arquitectura del nicho. La expresión o actividad desregulada de CTSK se ha asociado con trastornos de la densidad ósea y fenotipos de remodelación, así como con contextos más amplios de remodelación del tejido conectivo y cardiovascular.

cathepsin K El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CTSK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cathepsin K El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CTSK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CTSK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cathepsin K. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CTSK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cathepsin K en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cathepsin K en células tumorales con expresión de CTSK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.