cathepsin A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402785-ACT

CTSA kodiert Cathepsin A, eine lysosomale Serin-Carboxypeptidase, die zudem als protektive Proteinkomponente des Multienzymkomplexes mit Neuraminidase 1 und β-Galactosidase fungiert und deren Stabilität sowie den Transport in Lysosomen unterstützt. Über seine Deacylase- und Carboxypeptidase-Aktivitäten trägt Cathepsin A zum Umsatz von Glykoproteinen und Glykolipiden bei und hilft, die lysosomenvermittelte Proteostase im endolysosomalen System zu regulieren. Eine CTSA-assoziierte Dysfunktion stört die lysosomale Homöostase und den Substratabbau, wodurch das Gen mit der Biologie lysosomaler Speicherkrankheiten und nachgeschalteten Effekten auf zelluläre Stressantworten in Verbindung steht. Diese Prozesse machen CTSA relevant für mechanistische Untersuchungen der Lysosomenfunktion, der Proteinprozessierung und der metabolischen Umprogrammierung in humanen Zellmodellen.

cathepsin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTSA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cathepsin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTSA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTSA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cathepsin A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTSA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cathepsin A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cathepsin A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTSA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.