caspase-8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400147-ACT

O CASP8 humano codifica a caspase-8, uma protease cisteína iniciadora que acopla o engajamento de receptores de morte a cascatas de caspases a jusante e a programas regulados de morte celular. Atua no DISC para propagar a apoptose extrínseca e interage com o controle da necroptose por meio de interações com FADD, cFLIP, RIPK1 e RIPK3, moldando respostas inflamatórias e ao estresse. O CASP8 também influencia a sinalização imune e decisões de destino celular a jusante das vias de TNFR e Fas, com efeitos dependentes do contexto sobre a produção de citocinas e a sobrevivência. A desregulação da atividade ou da expressão da caspase-8 tem sido associada a sensibilidade alterada à apoptose, perturbações imunes e evasão, relevante para o câncer, de mecanismos de morte celular.

caspase-8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CASP8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

caspase-8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CASP8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CASP8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de caspase-8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CASP8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de caspase-8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via caspase-8 em células tumorais com expressão de CASP8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.